禽流感病毒(AIV)是一种能引起禽类发生严重急性传染病的A型流感病毒，其引起的禽流感被国际兽疫局(OIE)列为类A动物传染病。该病毒很容易发生变异，至今已发现了15个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型。其中，H5N1是一种高致病性亚型AIV，能引起禽类大规模死亡并给养禽业造成巨大的经济损失(Alexander, 1995; 2000)。有证据表明，H5N1亚型AIV还能通过多种途径传播给人类及其它多种哺乳动物，如：猫、狗、猪、虎等，导致其发病甚至死亡(Subbarao et al., 1998)。可见，H5N1除了对养禽生产具有严重危害外，对人畜生命安全也有严重威胁，具有重要的公共卫生意义(Class et al., 1998; Olsen et al., 2006)。

AIV基因组由8个独立的RNA组成，共编码10种蛋白。其中，HA蛋白是AIV的一个重要的表面抗原性蛋白，在病毒的吸附和穿膜、决定病毒致病力等方面起重要作用，也是病毒刺激机体产生中和抗体的重要抗原(Suarez and Schultz-Cherry, 2000)，在疾病的诊断和防治技术的研究中有重要意义。有关AIV HA蛋白的研究报道很多(Stephenson et al., 2004; 刘华雷等, 2005; 李靖等, 2006;郑其升等, 2006; 白霞等, 2008; 刘一尘等, 2009)，这些研究大部分是利用基因突变技术改造稀有密码子来实现目的基因的表达。密码子是mRNA链上决定一个氨基酸的相邻三个碱基，与基因遗传信息表达调控密切相关。外源基因mRNA密码子组成决定着外源基因在宿主中表达丰度。密码子具有通用性，不同的生物密码子基本相同，但不同物种在基因表达过程中对密码子的使用却存在明显的偏好性。相关研究表明，密码子的偏好性与宿主对外源基因的表达密切相关(Ikemura,1985; Kanaya et al., 1999; Archetti, 2004; Gustafsson et al., 2004; 黄琦等, 2008)。密码子使用指数(codon adaptation index, CAI)、最佳密码子使用频率(frequency of optimal codons index, FOP)、密码子偏好性指数(codon bias index, CBI)是其中评定外源基因表达的三个常用的密码子指数。CAI和FOP取值在0~1之间，值越大，密码子偏好性越大；等于1时，密码子偏好性达最大。而CBI取值≤1，密码子偏好性随CBI值升高而增大，当CBI值等于1时，密码子偏好性达最大；当CBI值为负数时，表示最优密码子的使用次数少于平均使用次数。此外，序列中稀有密码子的分布距离对外源基因的完整表达也有重要影响。本研究通过对H5N1亚型AIV HA基因的生物信息学进行分析后，选取一段抗原表位相对集中、稀有密码子分布有利于表达的区域，研究构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a(+)-HA，实现了该基因在大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中的高效表达。通过Western-Blot验证了表达蛋白保留了HA蛋白的免疫原性和反应原性，为下一步研究开发相关的诊断和防治技术打下基础。

1结果与分析
1.1 HA完整ORF序列分析
H5N1亚型AIV的HA完整ORF及抗原表位氨基酸序列和密码子分析结果见图1和表1。如图1所示，ORF基因编码的氨基酸序列全长为567 aa，蛋白质等电点为6.54；在ORF序列的共567个氨基酸密码子中，使用频率≤1%的有156个，使用频率≤0.28%的有23个，部分稀有密码子相距很近，甚至相邻并列出现。尤其是在第341~343位置并列出现的3个使用频率仅为0.28%的稀有密码子RRR。初步分析结果表明，HA ORF基因密码子组成本身十分不利于该基因在大肠杆菌中的表达。图1阴影部分为HA抗原表位序列，编码244 aa，蛋白质等电点为8.29。该序列氨基酸密码子共244个，其中，使用频率≤1%的一共有70个，使用频率≤0.28%的有9个，这些稀有密码子分布与HA ORF基因密码子相比，相对有利于目的蛋白在大肠杆菌中的表达。尤其是避开了第341~343位置上的3个使用频率仅为0.28%的稀有密码子RRR，有效降低了蛋白翻译提前终止的几率。

图1 H5N1 AIV HA基因编码的氨基酸序列在大肠杆菌中的密码子使用情况表(临界值为1%) Figure 1 codon frequency in H5N1 AIV HA amino acid sequence translated in Escherichia coli (critical frequency: 1%)

表1 HA基因在大肠杆菌中表达的稀有密码子(临界值为1%)分析 Table 1 Analysis of rare codons translated in E. coli from HA gene (critical frequency: 1%)

根据表1分析结果，本研究中的HA ORF氨基酸密码子在大肠杆菌中表达的分别为0.175、0.377、-0.090；HA抗原表位基因在大肠杆菌中表达的CAI、FOP、CBI值分别为0.177、0.374、-0.098。这些数值远低于大肠杆菌密码子的最佳偏好性指数1，说明大肠杆菌对这两个外源序列的密码子偏好性均很低，属于较难表达的外源基因。

1.2 HA ORF基因重组表达质粒的构建
对pET-32a(+)-ORF重组表达质粒转化菌进行PCR鉴定，筛选能扩增出1 704 bp预期目的片段的转化菌(结果见图2)，转化菌的质粒DNA测序结果经分析，与pMD18-T-ORF质粒中的H5N1 AIV的HA ORF序列一致，并与NCBI (national center for biotechnology information)基因数据库中的H5N1 AIV HA基因高度同源，结果见图3。证明目的片段已插入载体，成功构建了HA ORF基因重组表达质粒。

图2  重组表达质粒阳性菌落PCR扩增结果图 Figure 2 Results for the amplification of the clone contained recombinant expression vector

图3  pET-32a(+)重组质粒中插入的HA基因测序结果 Figure 3 Sequencing of the HA gene inserted in recombinant plasmid pET-32a(+)

1.3 HA抗原表位扩增及重组表达质粒构建
引物P3和P4对重组质粒pMD18-T-ORF DNA扩增所得到的732 bp目的片段，经1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，与线性化的pET-32a(+)载体连接，构建重组表达质粒pET-32a(+)-HA，转化大肠杆菌Rosetta-gami B (DE3)。通过PCR扩增，筛选能扩增出732 bp预期目的片段的转化菌(结果见图2)。转化菌的质粒DNA测序结果表明，所插入的732 bp目的片段为质粒pMD18-T-ORF中的HA ORF基因的抗原表位序列(结果见图3中阴影部分)。证明成功构建了HA抗原表位基因重组表达质粒。

1.4重组质粒的诱导表达
分别含有重组表达质粒的pET-32a(+)-ORF和pET-32a(+)-HA的大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)菌株，在不同浓度IPTG作用下诱导表达不同时间。表达产物经SDS-PAGE电泳分析，结果发现，IPTG浓度及诱导时间对HA ORF目的蛋白的表达量影响不明显。诱导表达菌体超声波沉淀物在约85.4 kD (65 kD+20.4 kD)处出现少量与预期目的一致的表达产物堆积，而上清及未诱导对照在该位置未发现有目的表达产物出现。同样，在HA抗原表位基因的诱导表达中，IPTG对目的蛋白表达量影响不大，但明显与诱导时间长短有关。当诱导表达过夜时，目的蛋白表达量最高。诱导表达菌体超声波沉淀物在约48.1 kD (27.7 kD+20.4 kD)处出现大量与预期目的一致的表达产物堆积，而上清及未诱导对照在该位置未发现有目的表达产物出现。图4和图5分别显示了HA ORF和HA抗原表位重组表达质粒在1 mmol/L IPTG诱导作用下，表达不同时间后重组蛋白表达量的变化情况。

图4 诱导时间对HA ORF重组蛋白表达的影响(1 mmol/L  IPTG) Figure 4 The affection of inducing time on the expression of HA ORF recombinant protein (1 mmol/L IPTG)

图5 诱导时间对HA抗原表位重组蛋白表达的影响(1 mmol/L IPTG) Figure 5 The affection of inducing time on the expression of HA antigenicity recombinant protein (1 mmol/L IPTG)

1.5 HA抗原表位重组表达蛋白纯化
HA抗原表位重组蛋白包涵体经6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后，样品经SDS-PAGE电泳分析，结果在约48.1kD处出现预期的目的重组蛋白条带，另外，在低于该位置也有数条较较明显的重组蛋白条带出现(结果图略)。

1.6 Western-Blot试验
Western-Blot试验结果显示，转移到硝酸纤维素膜上的HA抗原表位重组表达纯化蛋白，分别能与HA抗原表位重组蛋白的SPF鸡高免血清及H5亚型AIV标准阳性血清进行杂交显色，在48.1 kD位置及低于该位置的多个地方出现明显的特异性杂交带，而未免疫SPF鸡血清对照在任何位置均无特异性杂交带出现(图6)。

图6 HA抗原表位重组蛋白Western-Blot试验 Figure 6 Western-Blot results for HA epitopes recombinant protein

2讨论
H5N1禽流感是近年来在亚洲地区发生的较大规模高致病性禽流感，对禽类和人畜生命安全均造成了较大威胁。研究开发相关防治技术是有效防控该病的重要手段。本研究通过基因分析，研究构建了H5N1 AIV的HA抗原表位基因表达质粒，成功地对H5N1 AIV的HA抗原表位进行了表达，在对表达产物的抗原活性进行了研究后，证明了该基因表达产物具有良好的免疫原性和反应原性，为下一步研究开发H5N1 AIV相关诊断和防治技术奠定了基础。

大肠杆菌是基因工程技术中最常用的原核表达宿主菌，其密码子偏好性影响着外源基因在其中的表达丰度。经分析，本研究的H5N1亚型AIV HA ORF基因中大肠杆菌稀有密码子分布密集，其与外源蛋白表达密切相关的CAI、FOP及CBI指数均远低于1，序列中有些稀有密码子的使用频率甚至≤0.28%。稀有密码子距离的远近与外源基因的表达有很大关系。距离越近，影响就越大。特别是相邻并列的稀有密码子，如，图1 HA ORF序列中第341~343位使用频率仅为0.28%的3个相邻并列的稀有密码子RRR，更是严重阻滞了mRNA信息的传递，使蛋白翻译提前终止而最终影响目的蛋白的表达丰度(图4)。解决稀有密码子对外源基因表达丰度的影响，目前常用的方法是对基因进行突变。即利用同义密码子将原有的稀有密码子改造成偏好性较高的、利于表达的常用密码子。这种方法对于少量稀有密码子突变来说有一定意义(刘华雷等, 2005; 李靖郑等, 2006; 其升等, 2006; 白霞等, 2008; 刘一尘等, 2009)。但对大量稀有密码子进行改造则难度较大，不但要耗费大量的人力、物力，成倍增加成本，操作也十分繁琐复杂。

本研究在不改变原有基因信息的前提下，通过生物信息学软件分析，选择了其中抗原表位集中，稀有密码子之间距离相对较远的区域(如图1阴影部分)进行表达，结果得到了较理想的表达效果(图5)。通过对表达诱导剂IPTG的使用量和诱导时间的测试，发现目的蛋白的表达量与表达时间的有关，而与诱导剂的浓度无关。如图5所示，HA抗原表位重组表达质粒在1 mmol/L IPTG诱导过夜后，在48.1 kD处出现了相对丰厚的表达产物。说明外源基因氨基酸密码子组成是决定着外源基因表达的关键，同时，表达时间长短也对外源蛋白表达丰度有着重要影响。

图6 Western-Blot试验结果显示了HA抗原表位重组表达蛋白不但能与H5亚型AIV标准阳性血清起反应，出现特异性的杂交反应带。同时，利用该蛋白作为抗原免疫SPF鸡，所采集的免疫鸡血清也能与重组蛋白发生杂交反应，出现特异性杂交带。这些结果说明该重组蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。由此可见，本研究在生物信息学分析基础上所构建的H5亚型AIV HA抗原表位基因表达质粒，在大肠杆菌Rosetta-gami B (DE3)菌株中所表达的重组蛋白保留了天然HA蛋白的抗原活性，能作为HA蛋白的检测诊断试剂，在H5亚型AIV的防治技术研究中有重要的实际应用价值。

3材料与方法
3.1供试材料
H5N1亚型AIV HA完整ORF基因重组质粒pMD18-T-ORF、大肠杆菌Rosetta-gami B (DE3)、原核表达载体pET-32a(+)，本实验室保存；质粒DNA抽提试剂盒TIANprep Mini Plasmid Kit，购自天根生化科技(北京)有限公司；H5亚型AIV阳性血清，购自哈尔滨维科生物技术开发公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG抗体为promaga公司产品；6×His-tagged protein重组蛋白纯化试剂盒，购自德国GIAGEN公司；限制性内切酶EcoRⅠ、Taq DNA聚合酶等,购自大连宝生物工程有限公司；CloneEZ^®重组克隆试剂盒，购自南京金斯瑞生物科技有限公司；iBlot Gel Transfer Stacks购自invitrogen公司；MyCycler thermal cycler (Serial No.: 580BR 5540) DNA扩增仪，购自Bio-RAD公司。

3.2基因分析及引物设计
根据H5N1亚型AIV HA基因序列(GenBank登录号: GQ290463)及本实验室保存的质粒pMD18-T-ORF基因测序结果，设计了一对扩增HA ORF全长基因的引物P1和P2。同时，利用在线工具http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html、http://cmgm.stanford.edu/WWW/www_predict.html及Anthe5.0蛋白分析软件，对H5N1亚型AIV HA 基因编码的氨基酸、蛋白特性、在大肠杆菌中的偏好性及其稀有密码子分布情况等进行分析，选择其中抗原位点分布相对集中，亲水性较好，并且稀有密码子分布相对有利于后期表达的区域，设计一对针对抗原表位区域的特异性引物P3和P4。引物由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成，用dH₂O稀释成50 pmol/L的工作浓度。引物信息具体见表2。

表2  H5N1亚型AIV HA基因扩增引物信息 Table 2  Primers for HA gene of H5N1 AIV

3.3质粒DNA抽提
利用质粒DNA抽提试剂盒TIANprep Mini Plasmid Kit，按产品说明书提供的操作步骤对重组质粒DNA进行抽提。质粒DNA样品置-20℃保存备用。

3.4目的基因扩增及电泳分析 
目的基因扩增反应体系为100 μL，其中：25 mmol/L MgCl₂ 10 μL，10×PCR buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 units Taq DNA聚合酶1 μL，50 pmol/L的上游引物和下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，用超纯水补足体积至100 μL。DNA扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 s，35个循环后，72℃延伸5 min。扩增结束后，制备1%琼脂糖凝胶，取10 μL扩增产物在100 V电压下进行电泳。电泳结束后，用溴化乙锭对凝胶进行染色，最后在凝胶成像系统上对扩增产物进行分析并拍照。

3.5 ORF基因重组表达质粒的构建 
以抽提的pMD18-T-ORF重组质粒DNA为模板，按步骤3.4提供的方法，利用引物P1和P2对HA ORF基因进行扩增，并通过1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化1 704 bp的目的PCR产物。同时，用EcoRⅠ对pET-32a(+)载体进行酶切并回收纯化酶切产物。利用CloneEZ^®重组克隆试剂盒，将纯化的1 704 bp的PCR产物与酶切后线性化的pET-32a(+)载体连接，转化大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)。用引物P1和P2对插入的目的片段进行PCR扩增鉴定，并对阳性菌落的质粒DNA进行测序，筛选含目的片段并插入方向正确的质粒，命名为pET-32a(+)-ORF。阳性菌加30%终浓度的甘油，-20℃保存备用。

3.6 HA抗原表位基因扩增及重组表达质粒构建 
以抽提的pMD18-T-ORF重组质粒DNA为模板，按步骤3.4提供的方法，利用引物P3和P4对HA抗原表位基因进行PCR扩增。扩增结束后，通过1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化732 bp的目的PCR产物。同时，用EcoRⅠ对pET-32a(+)载体进行酶切，回收纯化酶切产物。利用CloneEZ^®重组克隆试剂盒，将纯化的732 bp PCR扩增产物与酶切后线性化的pET-32a(+)载体连接，并将连接产物转化大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)。挑选形成单菌落的转化菌，用引物P3和P4进行PCR扩增，对能扩增出预期目的片段的转化菌质粒DNA进行测序，筛选含目的片段并插入方向正确的质粒，命名为pET-32a(+)-HA。阳性菌加30%终浓度的甘油，-20℃保存备用。

3.7重组蛋白的诱导表达
以1%的接种量分别将含有重组表达质粒的pET-32a(+)-ORF和pET-32a(+)-HA菌株接种到含Cam (34 μg/mL)、Kan (15 μg/mL)、Tet (12.5 μg/mL)及Amp (50 μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养至生长对数期，当OD600读数在0.4~0.6之间时，加入不同浓度的IPTG (范围: 1~4 mmol/L)进行诱导表达，时间由0 h、2 h、4 h、6 h、8 h至过夜。离心收获菌体，并用适量PBS重悬,同时加入终浓度为100 μg/mL的溶菌酶，在冰上进行超声裂解，并用SDS-PAGE电泳分别对裂解物上清液与沉淀物进行检测。

3.8 HA抗原表位重组表达蛋白纯化及高免血清制备
将含有重组表达质粒pET-32a(+)-HA的菌株接种到含相应浓度抗生素的250 mL LB培养基中，按步骤3.7方法，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达过夜。收获菌体，用超声波裂解后收集包涵体沉淀。利用6×His-tagged protein重组蛋白包涵体纯化试剂盒对表达产物进行纯化。以200 μg纯化蛋白与等量的福氏佐剂混合制备成抗原，免疫2月龄SPF鸡，共3次。最后一次免疫后7 d，采血分离血清，-20℃备用。

3.9 Western-blot试验
重组蛋白纯化后进行SDS-PAGE 电泳,利用iBlot Gel Transfer Stacks转移试剂盒通过电转移将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，分别以HA抗原表位重组蛋白SPF鸡高免血清、H5亚型AIV标准阳性血清及未免疫SPF鸡血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG为二抗进行Western-Blot，分析重组蛋白的免疫原性及反应原性。

作者贡献
在庞耀珊为本研究的主要执行人，负责实验设计和大部分实验内容的操作、数据整理及撰写论文；谢芝勋为本论文的通讯作者，负责论文的修改和审核；谢丽基、邓显文、谢志勤、刘加波和谢体三五位作者为本研究的各项实验提供协助及建议。

致谢
感谢彭宜博士和范晴实习研究员对本研究的帮助；感谢中美泰和生物技术(北京)有限公司的技术支持。

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